Az egzotikus sejtek Oroszországban

Az egzotikus sejtek Oroszországban

Maria Lagarkova
"Science Firsthand" №4 (75), 2017

Az iPSC-kből differenciált idegsejtek és festékek (zölden – neuronok, piros gliáiis sejtek). Fluoreszcens mikroszkópia. Fotó szerző

Amikor 2006-ban a japán tudósok sikeresen megfordították a sejtfejlesztési programot, és egy felnőtt szervezet érett sejtjeit "gyermekkorba" vitték, ez volt az elmúlt évtizedekben a biológiai tudomány egyik legfontosabb fejlődése. A S. Yamanaka genetikai újratervezési technológiájának szerzője 2012-ben megkapta a Nobel-díjat, és új korszak kezdődött a biológia világában. Az iPSC-k (indukált pluripotens őssejtek) termelési technológiája lehetővé tette a betegségek modelljeinek kialakulását alapvetően új szintre, a kábítószerek megfigyelésére. Az azonnali kilátások új terápiás eszközök létrehozása: az iPSC-ben a patológiás genomikus szerkesztési módszerekkel végzett korrekció után a "korrigált" sejteket egy betegnek átültetik. Milyen esélye van ennek a munkának a sikerére? És mi az orosz tudósok szerepe ennek az ambiciózus projektnek a megvalósításában?

A szerzőről

Maria Andreevna Lagarkova – Az Orosz Tudományos Akadémia egyetemi tanára, a Biológiai Tudományok doktora, Moszkvai Állami Egyetem professzora. MV Lomonosova (Moszkva), a Fizikai-Kémiai Orvoslás Szövetségi Tudományos és Klinikai Központja Cell Biológiai Laboratóriumának vezetője (Moszkva). 75 tudományos cikk és 6 szabadalom szerzője és társszerzője.

Sajnálatos módon kevés olyan laboratórium van, amely az oroszországi őssejtekkel vagy iPSC-kkel foglalkozik: két intézet a Novoszibirszk Academgorodokban és több laboratórium Moszkvában és Szentpéterváron. Az évek során a szükséges szakemberek száma növekszik, de nem elég a nemzetközi csoportokkal versenyezni. Ha a fizika, Oroszország valahogy "megtartja a márkát", akkor a sejtbiológusok munkája külföldi kollégákra nem különösebben érdekes, és inkább egzotikusnak. Az oroszországi tapasztalatok a sejtbiológia nemzetközi projektjeiben külön tudósok külön munkája. Ráadásul Oroszország sikerrel hagyja figyelmen kívül a világ élményét. Tehát sok kérdés merül fel az orosz szövetségi törvény "Biomedical Cellular Products" -ról. Például nem teszi lehetővé a magzati és embrionális őssejtek használatát a sejttermékek létrehozásának forrásaként – ilyen tilalmak nincsenek az Egyesült Államokban, az Egyesült Királyságban vagy Japánban.

Az iPSC-k kolóniái a c-Myc és Nanog transzkripciós faktorokkal szemben ellenanyagokkal festettek. Fluoreszcens mikroszkópia. Fotó A. Bogomazova

Az Amerikai Egyesült Államok és Japán, a sejtbiológia területén vezető szerepet betöltő, a pénzügyi lehetőségekkel rendelkező és az intellektuális elit vonzására képes világszerte vezető emberek már megkezdték az első iPSC-sejttermékek klinikai vizsgálatát. Intenzív munkát végeznek a pluripotens őssejtek területén Nagy-Britanniában, Svédországban, Hollandiában és sok más országban. Természetesen, Európában, az Egyesült Államokban és Japánban egyaránt nem fogunk állni, azonban tudósaink néhány tanulmánya meglehetősen "par". A legfontosabb az, hogy erőfeszítéseket tegyünk, megértsük, mi történik a tudományos világban, megfelelően képviseljük magunkat a nemzetközi projektekben, és nem foglalkozunk azzal a ténykedéssel, hogy a világtudomány messze elment, és keresi azokat a füleket, ahol hatékonyan dolgozhat: érdekes jelenségek, korábban ismeretlen mechanizmusok. Laboratóriumunk hasonló réseket keres, és az egyikük a neurológiai betegségek kialakulásának molekuláris mechanizmusainak tanulmányozása, nevezetesen – ataxia, a gerincvelőt és a kisagyat érintő neurodegeneratív betegségek, amelyek a mozgások káros összehangolását eredményezik.

A sejtek "gyermekkori"

A multicelluláris organizmus különféle szöveteit alkotó sejtek sokféleképpen oszlanak meg a tojás megtermékenyítésének pillanatától az egyén haláláig. A szervezet fejlődési folyamatában a sejtek "differenciálják" (válnak szakosodottvá), és elveszítik az átalakulás lehetőségét más speciális típusokba. Normális esetben ez egy egyirányú folyamat, amelyet a genetikai program határoz meg: a differenciált sejt nem válhat újból.

Az egyirányú fejlődés folyamatának epigenetikai szabályozását az 1940-es évekig alakították ki. K. Waddington, aki szintén javasolta az "epigenetika" kifejezést – a génaktivitás változását, amely nem befolyásolja a DNS szerkezetét. Az elmúlt évtizedek biológiájának előrehaladása bizonyítja a sejt állapotának hatékony kezelését, a funkciók és a specializáció megváltoztatását.

Az első alkalommal, a sejteket "gyermekkorba" tértek vissza, melyet 2006-ban egy komplex tényezők segítségével helyeztettek el a helyes irányba. A japán kutatók K. Takahashi és S. Yamanaka, akik pluripotens sejteket kaptak az egér fibroblasztoktól, sikeresek voltak. Természetesen ezek a művek R. Briggs, T. King, J.Gerdon és más tudósok, akik bebizonyították, hogy egy felnőtt sejt magjának áthelyezése tojásmentes tojássejtekké válhat a genetikai program megváltozásához és egy új organizmus növekedésének kezdetéhez.

A pluripotens állapot megszerzésével és fenntartásával összefüggő 24 transzkripciós faktor kombinációjával foglalkozó Takahashi és Yamanaka azonosította az Oct4, Sox2, Klf4 és c-Myc fehérjék (jelenleg "Yamanaka koktél") olyan kombinációját, amelynek kifejeződése szomatikus sejtben átalakulásához vezet pluripotensben. Ezt a folyamatot "genetikai újraprogramozásnak" nevezik, és a talált sejteket "indukált pluripotens őssejteknek" nevezik (iPSc). Az újraprogramozási technológia egyetemesnek bizonyult, és lehetővé tette különböző típusú sejtek irizáló sejtjeinek megszerzését, nem csak egerek és emberek, hanem más állatok, köztük patkányok, kutyák és sertések is.

A ataxia molekuláris mechanizmusainak keresése

A neurodegeneratív betegségek kezelésével és vizsgálatával kapcsolatos fő probléma az, hogy az első tünetek megjelenésekor az élő, nem beteg sejtek száma annyira csökken, hogy sok esetben lehetetlen segíteni egy személynek, csak a palliatív terápiát támogatja.Ugyanezen okból nem könnyű tanulmányozni ezeket a betegségeket: a közvetett betegvizsgálatok (tomográfia, biológiai folyadékok analízise) nem elegendőek, és a halál után vett mintákban a szükséges sejtek már meghaltak – gyakorlatilag nincs mit tanulmányozni. Ezért ahhoz, hogy megértsük, mi történik egy adott patológiával a molekuláris szinten, szükségünk van állati és sejtmodellekre.

Hét évvel ezelőtt a doktori értekezés az iPSC-k, a sejtek jellemzésére irányult. Három évvel ezelőtt, ezek a témák költözött szintje mester munka, és ma – a munkaszint a főiskolai.

A ataxia kialakulásában a glutamin aminosavát kódoló génben a CAG-triplet többszörös ismétlése genetikailag "bűnös", ami a glutaminmaradékoknak bizonyos fehérjékbe való túlzott beépülését okozza.

Jelenleg 8 ilyen típusú rendellenesség létezik. Az 1. típusú spinocerebelláris ataxia egy ritka betegség, és főleg néhány beteg példáján tanulmányoztak, részben pedig állatmodellekben, de nem jutottak be a finom molekuláris mechanizmusokba. A betegség sejtmodelljeit hoztuk létre: egy páciensből bőrbiopsziát veszünk, a sejteket átprogramozzuk az iPScs-re, és differenciáljuk őket Purkinje neuronok kisagyat, amelyek ebben a betegségben degradálódnak.

A technológiailag helyes Purkinje neuron differenciálódási protokoll kidolgozása az első feladatunk, amelyet meg kell oldanunk. Fontos, hogy a protokoll reprodukálható legyen és "munka" minden sejtvonalhoz. A következő feladat az 1. típusú ataxia molekuláris mechanizmusainak keresése az iPScs használatával.

Az iPSC technológia gyakorlati alkalmazásai: szűrőanyagok a kábítószer felfedezéséhez és a mutációk kijavításához, majd a "gyógyult" emberi sejtek átültetése. By: (Nekrasov és munkatársai, 2014)

Az ilyen vizsgálatokban össze kell hasonlítani a beteg sejteket az egészségesekkel. A probléma az, hogy az emberek nem bizonyos sorok egerek, és az egyéni különbségek nagyban torzíthatják a képet. Ezért lehetetlen összehasonlítani egy beteg és egészséges személy sejtjeit – ugyanazon személyből származó sejteket kell használni. Ehhez meg kell "gyógyítani" a beteg sejteket, vagy be kell vezetni egy genetikai mutációt az egészséges sejtek genomjába.

Az 1-es típusú ataxia esetében a második lehetőség megfelelőbb: a CRISPR / Cas módszerrel megtanultuk a CAG ismétlését az egészséges sejt genomjába bevezetni.Ez a technológia már rutinszerűvé vált, és összehasonlítva a beteg és egészséges sejteket, tanulmányozzuk az RNS-molekulák és fehérjék "viselkedését", és keressük a betegség kialakulásának mechanizmusát. A munkálatok nagyon sikeresek.

A legtöbb neurodegeneratív betegség esetében még nem fejlesztették ki a hatékony terápiát. Ez annak köszönhető, hogy a kutatók korlátozott hozzáférést kaptak az emberi idegsejtekhez, és hiányoztak a megfelelő modellrendszerek a betegségek patogenezisének és a kábítószer-tesztelésnek.

A neuronok különböznek az iPSC-től. Antitest béta-III tubulin festés. Fluoreszcens mikroszkópia. Fotó szerző

Az ember számára olyan ilyen jellegű, gyógyíthatatlan neurodegeneratív betegségek, mint a Huntington-kór, új modellek keresése és fejlesztése rendkívül sürgős feladat. Az újonnan kifejlesztett genetikai újraprogramozási technológia lehetővé teszi a könnyen hozzáférhető sejtek (pl. A bőrfibroblasztok) számára az in vitro iPSC-k előállítását, amelyek viszont korlátlanul növekedhetnek a tenyészetben és differenciálódhatnak bármely olyan sejttípusba, beleértve a neuronokat is, amelyek szükségesek a neurodegeneratív molekuláris mechanizmusok tanulmányozásához patológia.

Napjainkban a Szövetségi Orvosbiológiai Ügynökség Szövetségi Kutató és Klinikai Központja (Moszkva) Fizikai-Kémiai Orvosának Cell Biológiai Laboratóriumában létrehozott sejtvonalak egyedülálló platformja a Huntington-kór tanulmányozásához. Használható egy rendkívül hatékony rendszer létrehozására, amely a betegség molekuláris mechanizmusainak elemzésére és az új neuroprotektánsok felkutatására szolgál a nagy áteresztőképességű szűrési módszerek alkalmazásával.

Ipcc okulisták és farmakológusok számára

A laboratóriumi munkaterületünk olyan művekhez kapcsolódik, amelyek eredményei orvoslás szempontjából gyakorlati jelentőségűek, bár eddig ez nem jelenti azt, hogy holnap valakit fogunk kezelni. Arról szól, hogy az iPS cellákból jusson pigment hámot retina. Itt megyünk a legyőzött ösvényen: az ilyen sejtek klinikai vizsgálata már megkezdődött Japánban.

A humán pluripotens őssejtek differenciálódásával nyert retinális pigment epitélium hexagonális sejt, amely sűrű sejt-sejt kapcsolatokat alakít ki. Fázis-kontraszt mikroszkópia. Méretarány – 100 mikron. Szerző: (Maksimov, 2012)

A pigment epitélium egy nagyon fontos sejt, de haláluk nagymértékben meghatározza a retina elváltozását. Az ultraibolya sugárzás ellen védelmet nyújtanak, a fotoreceptorok külső hártyás expanziós membránjait fagocitázzák (rögzítik), a retina és az érsejtek között gátolják a funkciót, támogatják a víz anyagcseréjét. Amint azt már bemutattuk, a pigment hámsejtek laboratóriumi állatokba való átültetése (beleértve a majmokat) jelentősen javítja a modellben előforduló betegség folytatását – retinális dystrophia.

Kidolgoztuk a retinalis pigment hámhártya megszerzését az iPSC-kből, de a további mozgás érdekében a molekuláris és sejtbiológusok, fiziológusok, histologusok és operáló orvosok közötti együttműködésre van szükség. Az ilyen unió ritkaság.

Most tárgyalunk az SB RAS (Novosibirsk) citológiai és genetikai intézetével, ahol a gyors öregedésű OXYS patkányok érdekes modellje van, amely más tünetek között korai retinopátiaazaz a retinális patológiát. Talán ez a modell alkalmas a kutatásunkra. Reméljük, hogy nem csak az embereket találjuk meg, akik patkányokon fognak működni, hanem ritka,A korunkban "veszélyeztetett" szakemberek – a hisztológusok és a fiziológusok – közös projektet indítunk, amely jó eséllyel eléri a klinikai vizsgálatokat.

Az orosz biológusok nem rendelkeznek hagyományokkal a tudományos együttműködés megteremtésében. Az Egyesült Államokban még a versengő csoportok is gyakran találkoznak, szemet hunytak a nézeteltérésnek, és felismerik, hogy az ilyen közös munka új szintre fogja hozni a kutatást. A cél elérése érdekében a tudósok megoszthatják a sejtkultúrákat, a laboratóriumi modelleket a betegségek, a berendezések. Laboratóriumunk az együttműködéssel nagyon szerencsés. Sok éven át együtt dolgozunk az Orosz Tudományos Akadémia S. N. Illarioshkin és munkatársainak Tudományos Központjával, az Orosz Tudományos Akadémia Citológiai Kutatóintézetével (E. V. Kaznacheyeva professzorral és munkatársaival) együtt számos más orosz intézettel és egyetemmel. Természetesen az Orosz Tudományos Akadémia Általános Genetikai Intézetének, Kiselev S. László professzornak sem szabad elfelejtenem, aminek köszönhetően az ország első humán iPS sejtekkel végzett munkája megkezdődött és megtörtént.

Organoid a szerv helyett

A sejt- és molekuláris biológia rendkívül érzékeny a "divatirányzatokra". Három évvel ezelőtt az "autofágia" rendkívül divatos szó volt, és sok sejtes folyamat kapcsolódott ehhez a koncepcióhoz. Korábban ez a szó "apoptózis" volt.Most divatos számunkra, hogy együttműködjünk a CRISPR / Cas genom szerkesztési módszerrel és beszéljünk exozomoknak – kis membránhólyagok, amelyek segítségével a sejtek "kommunikálnak" egymással.

Az egyik ilyen "divatos" terület, amelyet laboratóriumunk is foglalkozik, az ún sejtszervecskék, a pluripotens sejtek csoportjának önszerveződésének termékei. Ha a differenciálódás kezdetén a sejtek megfelelő irányba tolódnak, interakciós folyamatok kezdődnek közöttük, amelyek feltételesen meghatározzák "ahol a fej és a farok", és elkezdik reprodukálni az embrionális fejlesztési programot. Egy organoid növekszik, molekuláris és hisztológiai jellemzőihez hasonló sejtmemória egy vagy másik szervhez.

Az agy "úgynevezett" organoidja ", amely indukált pluripotens őssejtekből származik (iPScs). Fázis-kontraszt

Egyetlen őssejtből származó holland tudósok például bélszervi organoidot termesztettek, amely többféle hámsejtet tartalmazott (endokrin, szekréciós, támogató sejttípusok), és segítségével tanulmányozta, hogyan hatnak a baktériumok az intesztinális szövetekkel. Helicobacter pyloriamely a gyomor-bél traktus egyes betegségeinek oka (Dutta & Clevers, 2017). Ezt a folyamatot nehéz megnézni. in vivo még egy modellállaton is, de ez könnyen elvégezhető, ha organoidokkal dolgozik.

Laboratóriumunkban a szem szervorganizmusa, valamint az agy és a kisagy már növekszik, amellyel a ataxia tanulmányozását tervezzük.

Az organoidok, a sejtek önszerveződésének termékei képesek legalább egy szerv fiziológiai funkciójának elvégzésére. Többféle típusú sejtből állnak, és reprodukálniuk kell az organogenezis során előforduló folyamatokat egy élő szervezetben egy laboratóriumban. Az organoidokat nemcsak pluripotens sejtekből, hanem felnőtt őssejtekből, sőt differenciált sejtekből is gyűjthetjük. A fényképen – szem organoid, differenciált az iPSC-től. Fázis-kontraszt. Fotó szerző

Teszt csőszervek

A Novoszibirszk Novoszibirszk kutatóinak egy csoportja a Cytology and Genetics Intézet és az Orosz Tudományos Akadémia (Novoszibirszk) Novoszibirszk Kutató Intézetének, a Vérkeringési Pathológia Intézetének, a Kémiai Biológia és Alapkutatás Intézetének. Az akadémikus E.N. Meshalkina kifejlesztett szövetmérnöki megközelítést a vascularis regeneratív gyógyászat számára.

Az indukált pluripotens őssejtek irányított kardiovaszkuláris differenciálódásából származó vaszkuláris szerek. Fluoreszcens mikroszkópia. Szerző: (Shevchenko, Zakharova, 2014)

Ennek a témának a relevanciája arra a tényre vezethető vissza, hogy manapság gyorsan növekszik az érrendszeri betegségben szenvedő betegek száma, és az ilyen betegségek kezelése gyakran magában foglalja az autológ (donor) vagy szintetikus vírusok pótlását. Mindkét lehetőség korlátozott, az alternatíva a vaszkuláris szövettenyésztési protézis alkalmazása.

Novoszibirszkban olyan protokollt dolgoztak ki, amely olyan specifikus vaszkuláris sejtek előállítására szolgál, amelyek biopsziás anyagból képesek véredényeket kialakítani, valamint az emberi pluripotens őssejtek irányított differenciálódásnak alávetettek. A kapott vaszkuláris sejteket különféle funkcionális és molekuláris genetikai tesztekkel vizsgáljuk részletesen, majd szintetikus felületekkel töltjük le. Az így létrejövő vaszkuláris protézis hasonló a természetes véredény tulajdonságaihoz (Shevchenko, Zakharova, 2014).

Ritka homozigóta – esély az iPSC terápiára

Most vannak olyan technológiák és ismeretek, amelyek lehetővé teszik az iPSC-k számára a betegségek patogenezisének tanulmányozását és a kábítószerek szűrését. Bár még nem ismert, amikor a világtudomány megtanulja szerkeszteni a genetikai patológiákat az indukált pluripotens sejtekben és az újratelepítési sejtekben az emberekben.

Ezt a megközelítést még nem hajtották végre, és ha áttörés történik, akkor valószínűleg drága és hosszú lesz. Végtére is, csak a bőr biopsziájának megszerzésének pillanatától kapva egy iPSC-t, több hónap múlva Minden sejtvonalat szabványos GMP körülmények között kell készíteni (Jó gyártási gyakorlat, a helyes gyártási gyakorlat), vizsgálatokat végeznek a mutációk jelenlétére és a tumorok kialakulásának potenciális képességére.

De van egy alternatív megközelítés, amelynek eszméje S. Yamanake-hoz tartozik: az iPSC-k viszonylag univerzális vonalainak létrehozása. A probléma az, hogy olyan gének és fehérjék vannak, amelyek felelősek a szövetek kompatibilitásáért (gének fő hisztokompatibilitási komplex), és ha nem egyeznek meg a transzplantáció során, szöveti kilökődési szindróma alakul ki. Ezek a gének nagyon változatosak, tehát ha szerveket (pl. Csontvelő) kell átültetni, akkor annyira nehéz megtalálni a donort.Nagyjából elmondható, hogy minden ember a világon minden egyes 40 ezer emberből csak egy embernek adományozhat. A hisztokompatibilitási komplexum génjeinek egybeesése valószínûsége a testvérek között is csak egynegyed.

Mindannyiunknak két példánya van (allél) gén: kaptunk apját és a másikt az anyától. De vannak olyan emberek, akiknek a hisztokompatibilitási komplex génjeinek másolatai megegyeznek (azaz ezekre az allélokra homozigóta) egy boldog egybeesés. Az ilyen adományozók anyaga átültetésre alkalmas (még a szerveknél, még az iPSc-nél is) minden olyan személy számára, aki legalább egy allélegyezéssel rendelkezik. Becslések szerint az egészséges homozigóta sejtek harminc soros iPSC-je elegendő ahhoz, hogy biztosítsa a japán teljes populáció 25-30% -os átültetésének egybeesését, és ötven – körülbelül 75% -át. Természetesen nagyon ritka gén allélok vannak, de az ország lakosságának fele már nagyon jó.

Yamanaka ilyen homozigóták bankját gyűjti, és több, ezeken alapuló sejtvonalat már létrehoztak. A japánok számára könnyebb ilyen alappal összeállítani, mert nagy nyilvántartásaik vannak a potenciális csontvelő donorokról, amelyek a hisztokompatibilitási komplex ismert változataiból állnak.

Oroszországban a csontvelő-donáció gyakorlatilag nincs előmozdítva, ezért az adományozók alapja nagyon kicsi. Úgy vélem, hogy fejleszteni kell, mert ehhez csak véradományozásra van szükség (ezt megelőzően intravénás injekciót adnak be a gyógyszer, melynek következtében a csontvelő sejtek a vérbe kerülnek). Ez általános gyakorlat, például Németországban. Azt hiszem, Oroszország erre fog jönni.

Több mint tíz év telt el azóta, hogy felfedezték a szomatikus sejtek pluripotens állapotú genetikai újraprogramozását. Idén egy magazinban New England Journal of Medicine Az iPSC-ből származó sejtek első transzplantációjának eredményeit retinális dystrophiában szenvedő betegen publikálták. Az idő megmutatja, hogy az iPSC-ből (neuronok, inzulintermelő sejtek stb.) Származó sejtek bejutnak-e a széles klinikai gyakorlatba. Szerint a cikk szerzője – kell.

Oroszországban számos tudományos csoport használja az iPSC-ket a betegségek modellezésére, beleértve a neurodegeneratívokat is, genomikus szerkesztési módszereket létrehozó izogén rendszereket hoznak létre. Sokat dolgoznak a kromatin szerkezetének és epigenetikai állapotának változásánál az átprogramozás és a differenciálás során.

Az elmúlt években az iPSC-k segítségével számos érdekes, alapvető tudományos munkát végeztek a pluripotencia és a szövetspecifikus differenciálódás fenntartásának mechanizmusaiban. Ez a terület rendkívül versenyképes, de nagyon drága. Mindazonáltal az iPSC-k alkalmas eszköznek bizonyultak a betegségek molekuláris mechanizmusainak, az organogenezis és egyéb folyamatok tanulmányozásához.

irodalom
1. Bogomazova A.N., Vasina E.M., Kiselev S. L. és mások Genetikai sejtek újraprogramozása: új technológia az alapkutatáshoz és a gyakorlati alkalmazáshoz // Genetika. T 51. szám 4. P. 466-478.
2. Illarioshkin S. N. Huntington-kór mint a neurodegeneratív betegségek tanulmányozásának modellje // A Parkinson-kór és a mozgásszervi megbetegedések tanulmányozását végző Nemzeti Társaság közleménye. 2016. № 1. P. 3-11.
3. Maksimov V. V., Lagarkova M. A., Kiselev S. L. Gene és a retina betegségeinek sejtterápiája // Celluláris transzplantológia és szövettani mérés. 2012. V. 7. sz. 3. P. 12-20.
4. Nekrasov, E. D., Lebedeva, O. S., Vasina, E. M. és munkatársai a Huntington-kór tanulmányozására az indukált pluripotens őssejtekre alapozva // Kísérleti neurológia. 2012. V. 6. szám 4. S. 30-35.
5. Shevchenko I.S., Zakharova A.G.Tesztcsőszervek // Tudomány első kézből. 2014. T. 55. szám 1. P. 19-23.


Like this post? Please share to your friends:
Vélemény, hozzászólás?

;-) :| :x :twisted: :smile: :shock: :sad: :roll: :razz: :oops: :o :mrgreen: :lol: :idea: :grin: :evil: :cry: :cool: :arrow: :???: :?: :!: