Katalitikus RNS: a prebiológiai életből származó gyógyszer

Katalitikus RNS: a prebiológiai életből származó gyógyszer

Sydney Altman
"Tudomány első kéz" № 3/4 (57/58), 2014

Az 1960-as években megjelent RNS világkoncepció alapgondolata egyszerű: a prebiológiai evolúció korai szakaszában a korlátozott erőforrások szaporodására és versenyzésére képes tárgyak különálló RNS-molekulák voltak, majd később a fehérjék és a DNS csak kiegészítéssé vált, bár és nagyon fontos a genetikai információ általános áramlásához. Ez a fogalom, amely eredetileg a sci-fi szomszédságában állt, ma már határozottan elfoglalta helyét a világbiológiában.

A legfontosabb felfedezés az RNs S. Altman professzor laboratóriumában végzett RNS katalitikus tulajdonságainak felderítése az RNase P enzim vizsgálatában (jelenleg ezek az enzimkatalizátorok ribozimek). Az RNS katalitikus tulajdonságainak felfedezésére az Altman T. Cech-szel együtt a Nobel-díjat a kémia (1989) kapta. Az RNáz P természetének magyarázata lett a kiindulási pont a nem kívánt RNS, például bakteriális megsemmisítésének eszközeivé. Az ilyen kezelési stratégia az emberiségnek a győzelmet ígéri a versenyben, ami még mindig elveszettnek tekinthető, az új gyógyszerek és az azokkal szembeni ellenállás között, melyeket a baktériumok szereznek.

A szerzőről

Sydney Altman – Sterling professzor molekuláris és sejtbiológiai és Fejlődésbiológiai Intézet, Yale University, egy kémiaprofesszorához Yale Egyetem (USA), vezetője az SB RAS (Novosibirsk) orosz-American Laboratory of Biomedical Chemistry, Intézet Chemical Biology és alapvető Medicine. A Nobel-díjas kémia (1989) győztese, amelyet T. Cech-vel közösen szereztek "az RNS katalitikus tulajdonságainak felfedezésére".

Napjainkban megnézhetjük a prebiológiai evolúció rejtélyes idejéből – az RNS-molekulák -, amelyek nem a genetikai információ DNS-ből a fehérjéig történő közönséges átadásával foglalkoznak, hanem teljesen más dolgokban, amelyek nélkülözhetetlenek a szervezet létfontosságú tevékenységéhez. Számos szabályozó, katalitikus, adapter és strukturális RNS létezése megmutatja, hogy a legkorábbi, mégis prebiológiai, életet hogyan lehetett szervezni.

Az emlékek egyike az elmúlt negyven évben egy egzotikus biokémiai kíváncsiságtól ment el az esetleges "csodákért" minden betegségért. Ez a történet azt mutatja, hogy egy kivételes alapkutatásban egy új ötlet hirtelen születhet,potenciálisan képesek átalakítani az emberi tevékenység legfontosabb területét – az orvostudományt. A mi esetünkben ez az objektum RNSse P – enzim, amely a poszt-transzkripcióban (vagyis a DNS-ből való leolvasás után) szerepet játszik az RNS módosításában.

Az RNS-ről "a bábukra"

A molekuláris biológia központi dogmájával összhangban az örökletes információk "szövege", amelyet RNS-nukleotid betűkkel írt (például … AAAUUGAGAUC …), a fordítási folyamat egy másik szövegébe, betűk-aminosavakba írták le. A kódoló RNS mátrix transzlációját, vagyis a fehérje szintézisét riboszómák – speciális sejtmakromolekuláris fehérje-termelő gépek végzik. A riboszóma működése lehetetlen két további RNS-osztály nélkül, amelyek már nem kódolnak: riboszóma RNS (rRNS) és transzport RNS (tRNS).

E. coli riboszómák (baktériumok Escherichia coli), a molekuláris biológia munkahorsa, három különböző rRNS molekulát tartalmaz, és négyünk van. Úgyhogy az élet nem úgy néz ki, mint a méreg biológusok, mindegyik rRNS E. coli amelyet hét különböző gén kódol, amelyek nagyon hasonlóak egymáshoz; az emberiség helyzete közel azonos.

De ha megnézzük a tRNS-t,itt még bonyolultabb: az E. coli 86 genot kódoló tRNS-t tartalmaz 20 standard aminosav számára, de 497 nukleáris és 22 mitokondriális transzport RNS-sel rendelkező ember messze elmarad. Természetesen ilyen számos különböző tRNS-t több mint elegendő ahhoz, hogy 20 aminosavat vagy akár 61 triplet antikodont kódoljon. Az ugyanazon tripletet tartalmazó tRNS-molekulák közötti különbségek némelyike ​​funkcionális jelentéssel bír, és a sejt a körülményektől függően bizonyos típusú tRNS-t használ.

A tRNS struktúráját gyakran "lóhere levélként" ábrázolják. Valójában meglepő, hogy egy ilyen viszonylag rövid lánc (a legtöbb tRNS 75-95 nukleotid hosszú) négy ágra, a "szárra" és a három hurkot tartalmazó szerkezetre hajlik. Az egyik hurkon található antikodont – egy három nukleotid régió, amely felismer egy olyan kodont, amely egy specifikus aminosavat kódol a messenger RNS-ben.

A fő hurok mellett a tRNS egy úgynevezett változó hurokot is tartalmaz, amelynek hossza fő jellemzője, hogy a tRNS két csoportra tagolódik: az I. osztályú tRNS-hez rövid (3-5 nukleotid), és a II. Osztálynál is hosszabb lehet, mint a fő hurok.Az akceptor szár tartalmaz egy rövid egyszálú régiót a 3'-végén (általában 4 nukleotid hosszúságú), véget érve a CCA szekvenciával (CCA), amely képes egy aminosav kovalens kötésére aminosav-tRNS-nek, amely a fehérje szintézis fő építőeleme.

De egy ilyen jól ismert kép egy lóhere levélrel csak egy diagram: a tRNS valódi térbeli szerkezete teljesen más, és nagy valószínűséggel hasonlít a "6" 6 × 6 nm méretű "G" betűre, amelyben az akceptor szárának antikodonja és 3'-vége a lehető legnagyobb távolságra van. .

"Olvashatatlan" ribozim

Tipikusan a tRNS hosszú prekurzor molekulának szintetizálódik (például baktériumokban, több szomszédos gént általában "egyetlen RNS-molekulánként" olvasnak). Ezért az érlelés során a tRNS-t hosszabb átiratból vágják le. Ezt a folyamatot az RNáz E enzim végzi, ugyanakkor a tRNS prekurzor 5'- és 3'-végénél még néhány extra nukleotid marad, és más, specifikus nukleázok hatása szükséges eltávolításukra.

Az egyik ilyen enzim, az RNáz P, úgy van kialakítva, hogy eltávolítja a nukleotidokat a tRNS prekurzor 5'-végétől.Ez a nukleáz a hetvenes évek eleje óta a laboratóriumomban a munka középpontjában áll, amikor rájöttünk, hogy a tRNS szintézise a prekurzor RNS-jéből származik. De természetesen a legfontosabb és váratlan felfedezésünk a nukleáz iránt, amely 1983-ban jelent meg a folyóiratban sejt, az volt, hogy észlelje a katalitikus tulajdonságait alkotó RNS. Más szóval, az enzim nem fehérje, hanem RNS – most ilyen katalizátorokat neveznek ribozimoknak.

Az RNáz P enzim minden élő szervezetben legalább egy fehérjével rendelkező komplexben található. A katalitikus RNS mellett a bakteriális enzim csak egy fehérjét (RnpA) tartalmaz. Szerző: (Walker Engelke, 2008)

Tény, hogy az RNase P RNS soha nem működik önmagában. In vitro katalizálja a reakciót, de minden élő szervezetben legalább egy fehérjével és magasabb organizmusokkal (eukariótáka) az utolsó tíz év számát. Annak ellenére, hogy az RNS még a fehérjék eltávolításakor is részben katalitikus aktivitást tart fenn, nem képes olyan sejtekben dolgozni, amelyek teljesen hiányoznak az RNáz P egyik fehérjék összetevőjétől. Mindazonáltal logikus feltételezni, hogy minden ma ismert RNáz P egy olyan prekurzorból származik,amikor ez az "ős" létezett: az "RNS-világ" legkorábbi evolúciós idejében, vagy később, amikor a fehérjeszintézis csővezeték megkezdte a modern megjelenést.

Az RNase P hatásmechanizmusának tanulmányozása lehetővé tette számunkra, hogy minimális követelményeket támasszanak a hordozóra. Mit kell kinéznie az RNS molekulának, hogy fel tudja ismerni és megragadja ezt a ribozimot?

Csodálatos módon egy lóhere levélszerkezet nem szükséges ehhez egyáltalán. Az RNáz P hatékonyan hasít minden olyan RNS-t, amely hasonlít a tRNS-szárhoz, azaz részben kettős szálú, szabad egyszálú 3'-végű RCCA (ahol R az adenin vagy guanin maradék). Az RNáz P ezeket a szubsztrátumokat az 5'-terminálisból azon a ponton szétvágja, ahol a kettős szálú DNS véget ér, és elkezdődik az egyszálú "farok". Még akkor is, ha egy célpontként egy RNS-t veszünk fel bármelyik szekvenciával, a másik pedig kiegészíti azt RCCA farokkal (az ún. külső vezető szekvencia), akkor a cél még mindig fel lesz osztva.

Az RNáz P enzim szerepet játszik a nukleotidok eltávolításában a prekurzor tRNS 5 'végétől a 3' – "farok" mellett. Azonban kiderült, hogy munkája nem igényli a "lóhere levél" szerkezetét, amelyben a tRNS általában képviselteti magát.Az RNáz P hatékonyan hasít minden olyan RNS-t, amely hasonlít a tRNS "szárához", vagyis részben kettős szálú, szabad egyszálú 3 'véggel. Az enzim ezeket a szubsztrátumokat az 5'-oldalról elszakítja azon a helyen, ahol a kettős szálú DNS véget ér és az egyszálú farok kezdődik

Az ilyen "olvashatóság" okai egyértelműen az RNase P szerkezetéből származnak, amelyet röntgen-analízissel dekódáltunk. A ribozim a szubsztrátot elsősorban a szerkezete megfelelőségének megfelelően az aljzat alakjához kötődik, és specifikus komplementer kötések csak a 3'-végű régióban alakulnak ki, ahol az állandó fark található. Ezenkívül még egy kémiailag módosított útmutató RNS is használható, ha csak az elismeréshez szükséges szekvenciákat tartalmazza.

Az archaea – egysejtű prokariótákban, amelyek bizonyos gének és anyagcsere útjai közelebb vannak az eukariótákhoz, mint a baktériumokhoz – az RNáz P képződéséhez az RNS 4-5 fehérjéhez kötődik, amelyek közül egyik sem hasonlít az RnpA-hoz. Eukariótákban legfeljebb tíz fehérje kapcsolódik a katalitikus RNS-hez, amelyek közül néhány homológ az archaeal fehérjékkel szemben, míg mások az eukariótákra egyedülállóak. Szerző: (Walker Engelke, 2008)

A kábítószer-ellenállás ellen

Az RNase P szubsztrát-specifikusságának magyarázata kiindulópont volt a további vizsgálatokhoz. Mivel szinte bármilyen RNS-t szét lehet osztani az RNase P használatával, miért nem fordíthatjuk azt szerszámba, hogy elpusztítsuk a nem kívánt RNS-t? Ha például egy külső vezető RNS-t vezetnénk be patogén baktériumok sejtjeibe, saját RNáz P megsemmisítené a komplementer sejtes RNS-célt, amelynek elvesztése halálos lenne a baktérium számára.

Ez szükséges? Az antibiotikumok széleskörű, ellenőrizetlen alkalmazása a kábítószer-rezisztens mikrobák előfordulásának növekedéséhez vezetett. A megjelenés egyik fő oka, hogy a baktériumok könnyen kicserélhetik a genetikai anyagokat (plazmidok), amelyek gyakran antibiotikum rezisztencia géneket hordoznak. Tehát ha egy ilyen plazmid bizonyos baktériumok populációjában, vagy akár különböző fajokból álló mikrobiális ökoszisztémában jelenik meg, akkor hamarosan valamennyi tagja vivővá válik, ha a megfelelő antibiotikum jelen van a környezetben. Minden más bakteriális sejt egyszerűen kihalódni fog.

Szükséges tisztázni, hogy a gyógyszerrezisztencia más okokból is kialakulhat, mint a célprotein mutációja a gyógyszerben, a sejtek túl sok célprotein termelése, valamint a gyógyszer eltávolításáért felelős gének aktiválása. Általánosságban elmondható, hogy a kábítószer-ellenállás problémája és az ezzel járó kockázatok mérete óriási. Például a több gyógyszerrel szemben rezisztens tuberkulózis formái, amelyek nem érzékenyek az elsődleges antibiotikum antibiotikumokra (izoniazid és rifampicin), és felelősek az új esetek 4% -áért és a betegségek ismétlődésének 20% -áért felelősek a mai világban. Ha a tuberkulózis baktériumok szintén kifejlesztették a kinolon antibiotikumokkal szembeni rezisztenciát és a második vonalú gyógyszereket – a kanamicint, stb., Akkor a betegség nagyfokú gyógyszerrezisztenciával jár. És az ilyen esetek a világon több tízezer évente vannak. Add hozzá Indiában, Iránban és Olaszországban, már vannak olyan tuberkulózisos esetek, amelyeknek a teljes gyógyszerrezisztenciája van, ami elvben nem alkalmas bármely modern antibiotikumra.

A helyzet nem javul és az a tényhogy egy új antibiotikum fejlődése több millió dollárba kerül, és a gyógyszeripari vállalatok nem állnak sorba, hogy ezeket a milliókat a olcsó fogyasztók számára egy keskeny fogyasztói csoport számára terjesszék. Azok a betegek, akik tétovázás nélkül több tízezer dollárt töltöttek volna a rák kemoterápiájára, hosszú hónapokra hosszabb ideig tartó életet éltek, vonakodva száz dollárt fizetnek a fertőzés kezelésére.

Pontos találat

Az RNáz P külső vezető szekvenciáinak terápiás potenciáljának felismerésével elkezdtük keresni a módját, hogy hatékonyan eljuttassuk őket a baktériumok sejtjeihez. Ebből a célból a vezető szekvenciákat speciális peptidekhez (rövid fehérjefragmensekhez) kapcsolták, amelyek lyukká alakíthatók a baktériumok sejtfalában, vagy aktívan szállíthatók a sejtbe. Ebben az esetben a vezető szekvencia egyfajta "utas" szerepét játssza.

Egy másik fontos döntés a vezető szekvenciák kémiai tulajdonságainak megválasztása volt: nem a szokásos RNS-t vagy DNS-t használtuk, hanem az ún. morfolino-oligonukleotidokamelyben a ribóz vagy dezoxiribóz szénhidrátmaradék helyett egy heterociklusos morfolinocsoport van.Az ilyen konstrukciók stabilabbak a sejtekben, és szigorúbb komplexeket képeznek az RNS-célokkal.

Célként a gyrA génből átíródott bakteriális mRNS-t használtuk, amely a baktériumok replikációjához szükséges DNS-giráz enzimet kódolja. A DNS-gyráz inaktiválása végzetes a bakteriális sejtek számára. Ezért a giiráz az antibiotikumok olyan fontos csoportjainak ismert célpontja, mint a fluorokinolonok (például a közelmúltban népszerű ciprofloxacin antibiotikum) és aminokumarinek.

A gyrA gén annyira konzervatív, hogy lehetővé vált egy vezető szekvencia létrehozása, amely számos patogénnél közös. Laboratóriumunkban a vezető szekvenciák baktericid tulajdonságait többféle típusú baktériumban vizsgálták, amelyek vagy kórokozók vagy veszélyes baktériumok modellek. A legtöbb esetben kábítószerünk használata során a baktériumok kevesebb mint 1% -a túlélett, bár be kell jegyezni, hogy a gyógyszer koncentrációja meglehetősen magas volt a szokásos antibiotikumok munka koncentrációjához képest.

Az első sikernek köszönhetően figyeltünk egy másik betegségre – a maláriára. A malária egyik kórokozója, Plasmodium falciparum, nem utal baktériumokra, hanem egysejtű eukariótákra. Ennek a parazitának a klinikai izolátumaiban azonban számos antimaláriás gyógyszer ellenállása is megfigyelhető. Amikor kifejlesztettünk egy útmutató szekvenciát a plazmodium DNS-girázot kódoló mRNS célzott hasítására, és fertőzött vörösvérsejtekre vittük be, a parazita megállt. Ugyanakkor nagyszerűnek bizonyult, ha bemutattuk a bakteriális gyrA génre kifejlesztett célzási szekvenciákat, vagyis ebben az esetben a célmRNS-t specifikusan elpusztítottuk P. falciparum.

Sok szerencsétlen szerencsétlen drog véget ér a pályafutása során, amikor az ígéretes előzetes eredmények ellenére nem mutatnak tevékenységet egy élő szervezetben. Ezért a következő lépcsőben a valósághoz közelebbi helyzetben próbáltuk megközelíteni a megközelítésünket – a göbös sebekre.

Természetesen a tudomány kedvéért nem az emberek szenvedtek, hanem laboratóriumi egereket, amelyeket beadtak a hátába, és felfüggesztették a létrejövő sebben előforduló Staphylococcus aureus, az emberi bőrfertőzések gyakori kórokozóját. Másnap a sebet speciális gél borította,amely a bakteriális gén mRNS-hez irányított morfolino-oligonukleotidot tartalmaz, korábban jól bizonyítottan antibiotikum törzsekre érzékeny és rezisztens; a kontroll nem specifikus szekvencia vagy normál só. Kiderült, hogy a sebek jelentősen gyorsabban meggyógyultak aktív morfolin-oligonukleotidokkal kezelt egerekben, összehasonlítva a kontrollcsoportokkal. A mikroszkópia adatai alapján a kezelés a hám és az érett kollagén réteg jobb regenerálódásához vezetett. Ráadásul az ilyen egerek sebében a baktériumok száma is sokkal kisebb volt. Így az emlősök testében végzett szigorú aktivitási tesztet – legalábbis egerekben végeztük el.

Az RNase P ribozim hatására alapuló kezelési stratégia az emberiség számára olyan győzelmet ígér egy olyan versenyben, amelyet eddig elvesztettnek tekintettek: az új gyógyszerek és az azokkal szembeni ellenállás között, melyeket a baktériumok szereznek. Végtére is, amikor egy új gyógyszer kifejlesztése 100 millió dollárba kerül, és 10 évre van szükség ahhoz, hogy az ötletből a gyógyszertári polcba jusson, és a baktériumok egy vagy két év alatt teljesen ellenállnak, akkor nincs ok a kitalálni a győztesre.

A bakteriális RNS specifikusan lebontó gyógyszerek drasztikusan megváltoztathatják ezt a helyzetet. Miután megerõsítette a vegyületek e csoportjának biztonságosságát és hatékonyságát, például a sejtbe való bejutásra alkalmas specifikus peptidhez kapcsolódó morfolin-oligonukleotidokat, az útmutató szekvencia szabadon megváltoztatható úgy, hogy különbözõ létfontosságú kórokozó géneket céloz meg. Vagy még a célpontok kombinációját is, ami szinte lehetetlenné teszi a gyógyszerrezisztencia kialakulását. Végül, és a farmakológiánál ez inkább kivétel, mint a szabály – az azonos típusú gyógyszerek képesek a baktériumok, protozoák és gombák, esetleg vírusok és bizonyos típusú rákos sejtek kezelésére. Ehhez csak találjon módot arra, hogy a kábítószert a megfelelő helyen szállítsa.

Miért támaszkodnak az orvosok még sok évvel ezelőtt az ampicillinre, a klorokinra és más arzenálokra a fertőzések kezelésére? A válasz elsősorban a gazdasági síkon áll. A morfolin (és bármely más) célzási szekvencia valóban drágább, mint a hagyományos antibiotikumok, amelyeket tömegesen állítottak elő,és a gyógyszergyártók félnek attól, hogy a betegek és az orvosok inkább a régi gyógyszerek használatát szeretnék használni. Az árkülönbség azonban nem olyan nagy: az egyik dózis 2-3 dollárba kerül, mint egy normál antibiotikum adagja. Az RNase P célzási szekvenciákon alapuló terápia hatékony, és kevesebb mellékhatással rendelkezik. Véleményünk szerint eljött az idő a tudósok, az orvosok, a gyógyszergyártók és az állam erőfeszítéseinek egyesítésére, és olyan új technológiákba fektetnek be, amelyek hatalmas előnyökkel járnak mindenkinek.

A szerző köszönetét fejezi ki, D. B. n. D. Zharkova (ICBFM SB RAS, Novosibirsk) a szerző 2014 májusában Novoszibirszkben adott előadáson alapuló kiadvány elkészítésére. Ezt a munkát az Orosz Föderáció kormánya (2013) támogatta.

irodalom
1. Vlasov V. V., Vorobyev P. E. Az RNS világa: Tegnap és Ma // Science Firsthand. 2012. № 3 (45). 40-49.
2. Gorman K., Fayn Maron D. Forradalom az RNS világában // A tudomány világában. No. 6. P. 70-77.
3. Grigorovich S. Az elején az RNS volt? A First-Life Molecule keresése // Science and Life. 2004. № 2.


Like this post? Please share to your friends:
Vélemény, hozzászólás?

;-) :| :x :twisted: :smile: :shock: :sad: :roll: :razz: :oops: :o :mrgreen: :lol: :idea: :grin: :evil: :cry: :cool: :arrow: :???: :?: :!: