Különböző mérlegeken

Különböző mérlegeken

A. A. Vakulka
"Kémia és élet" №11, 2013

Azok, akik az élő rendszereket vizsgálják, megkülönböztetik a kísérletet in vivo és in vitro: egy egész élőlény és üveg, orosz – egy kémcsőben, a testen kívül. Most új tudásmódszert hoztak: kísérlet szilikagélen, azaz "szilícium" -on, amelyből számítógépes chipeket készítenek. A biokémiában ez a kémia 2013-as Nobel-díjas nyerteseinek köszönhető. Ezt megkapta Martin Karplus, Michael Levitt és Arieh Varshel, mert megalapozták a komplex vegyi rendszerek – köztük a biomolekulák – modellezését klasszikus és kvantummechanikai módszerekkel.

Most a klasszikus és kvantum-megközelítések kombinációja szabványnak tekintendő, de a jelenlegi Nobel-díjasok először adták össze őket, mindkét módszerrel egy rendszer kiszámításához. A Nobel-díj népszerű sajtóközleményének szerzői vicces képekkel illusztrálják ezt: az első Newton (klasszikus mechanika) Schrödinger macskáján (kvantummechanika) almát dob, a másodikban egy macska Newton ölében ül, nyitott doboz almafa alatt áll, és mindenki boldog.

Mi volt a klasszikus és kvantum megközelítések egyidejű használatának összetettsége? Olyan modellek, amelyek klasszikus mechanikát alkalmazó molekulákat írnak le,atomok és atomcsoportok egészét tekintve – sokkal kevesebb szabadsággal rendelkeznek, és könnyebben kiszámíthatók egy számítógép segítségével … A kvantumkémiai modellek külön leírják az elektronokat és a magokat, és ez annyi lehetőséget kínál, hogy a leghatékonyabb számítógépek képesek számításokat csak a egyszerű molekulák. A Nobel-díjasok olyan kombinált megközelítést alakítottak ki, amelyben a rendszer központi részét kvantumkémiai módszerekkel írják le, a többi pedig klasszikus törvényekkel, amelyek mind fizikailag kapcsolódnak egymáshoz.

A pragmatizmus győzelme

V. V. Rybkin,
A kémiai tudomány kandidátusa,
Karlsruhe Műszaki Egyetem

Nem tudom, hogy a szakmai közösségek idén elfogadják a fizika Nobel-díját, de biztosra tudom mondani, hogy az "elméleti és számítástechnikai vegyészek" közössége a Martin Karplus, a Michael Levitt és az Arieh Varshel díjakkal kapcsolatos. Egyrészt jó, hogy a teoretikusok elnyerték a díjat, ez ritkán fordul elő (utoljára 1998-ban Walter Kohn megkapta a sűrűségfunkcionális elmélet kifejlesztéséért és John Popl számára a kvantumkémiai számítási módszerek kifejlesztéséért).Másrészt sokan úgy vélik, hogy a klasszikus mechanika segítségével a többszintű modellezés nem túl komoly. Nem sokkal ezelőtt a Quantum Chemistry Európai Nyári Iskolájában az egyik professzor szó szerint a következőket mondta: "Az ilyen számítások kilencven százaléka értelmetlen." Kevesen mondják ki hangosan, de ez nem jelenti azt, hogy nem hiszik.

A sajtóközleményekben sokszor azt írták, hogy Karplus, Levitt és Varshel barátok voltak Newtonnal és Schrödingerrel, és a klasszikus és kvantummechanikát ötvözték számításukban. Azonban, valójában nem tudsz barátokat teremteni: egyik sem a másik. A valóságban természetesen Schrödinger – vagyis a kémiai átalakítások kiszámításához szükség van a kvantummechanikára: a bizonytalanság elve, a valószínűségi hullámok, az alagút stb. Miatt. Mivel a molekulák nem gömbölyű atomok, amelyeket rudak kötnek össze, de sokkal összetettebbek tárgyakat. A tudomány régóta megalapozta ezt a tényt, és úgy tűnik, hogy előrelépett, de hirtelen 40 évvel a kvantummechanika felfedezését követően Newton újra megjelenik. Ezért a 2013-as 2013-as Nobel-díjasok munkája a kémia területén egy lépést jelent a fizikai elmélet szempontjából.És néhány purista az elméleti kémikusok számából.

Általánosságban elmondható, hogy az elméleti kémia lényege jól tükrözi az angol fizikus és teoretikus Paul Dirac állítását: egyenleteket. " Az elméleti kémikusok fő foglalkozása az, hogy egyszerűsítsék ezeket a "túl bonyolult egyenleteket", miközben egyensúlyt tartanak a pontosság és a rendelkezésre állás között. Ezért olyan modellekkel foglalkoznak, amelyek többek között a klasszikus fizikát használják.

Két villa

A "klasszikus" és a "kvantum" aránya az elméleti modellezésben némileg bonyolultabb, mint a Nobel-díj népszerű kiadványaiban. Ez az arány legalább két dimenzióval rendelkezik (lásd az ábrát).

Molekuláris modellezési módszerek

Először is, tisztázzuk a fogalmakat: a molekulák nem atomokból, hanem atomokból és elektronokból állnak. A magok mozgása meghatározza a molekulák geometriai alakját, és végső soron a kémiai reakciókért felelős, így a magokat gyakran továbbra is atomoknak nevezik.Szinte minden elmélet azt sugallja, hogy bizonyos közelítésben (a Born-Oppenheimer approximációként ismert) a magok és az elektronok külön-külön mozognak. A magok lassan mozognak, és az elektronok szinte azonnal átrendeznek mögötte – valójában követik a magokat. Ugyanakkor mindkettő és mások nem mozognak egymástól függetlenül: az elektronok teljes energiája a magok potenciális energiájaként szolgál. Ez azt jelenti, hogy a magok kölcsönhatását egymással elektronok határozzák meg. Ezért a magok mozgásának problémájának megoldásához először meg kell oldania az elektron mozgásának problémáját. A magok (és nem csak) közötti kölcsönhatást nevezzük a mag potenciális energiájának, vagy egyszerűen a potenciálnak. Ezt a szót fogjuk használni a jövőben.

Itt jelenik meg az első "kvantum-klasszikus" villa: hogyan kell kiszámítani a magok közötti kölcsönhatást? Őszintén megoldhatja a kvantumelektron problémát (a potenciális "kvantum" kiszámítása), vagy klasszikus potenciállal helyettesítheti: képzelje el, hogy a magok kölcsönhatásba lépnek egymással, mint a rugók súlya, ponttöltés stb. Az ilyen erőmező paramétereit általában meghatározzák kísérleti adatok alapján.A kvantumkémia felelős az elektronikus probléma megoldásáért, és a molekuláris mechanika a klasszikus potenciálokkal foglalkozik.

Miután meghatároztuk a potenciált, megtaláljuk a második kereszteződést: hogyan kell a magokat klasszikus vagy kvantum tárgyakként kezelni? Két irány van: a magok kvantumdinamikája és a klasszikus dinamika, más néven molekuláris dinamika. Jobbra fogsz menni – elveszíted a pontosságot, a bal oldalon – egyszerűség.

Most vissza a rendszerhez. Minden, ami a klasszikus potenciálhoz kapcsolódik (erõs mezõk helyett elektronok) molekuláris mechanika (MM). Az MM ellentétben van a kvantumkémia módszereivel, amelyek főként elektronokkal foglalkoznak, és amelyek segítségével kvantumpotenciálot kapnak. A klasszikus (Newton szerint) nukleáris mozgáshoz kapcsolódó minden elemet molekuláris dinamikának (MD) nevezik: az erőszakkal rendelkező MD-t rendszerint MD klasszikusnak és kvantumpotenciálnak nevezik, félklasszikus MD-t. A kvantumdinamika dinamikájára nincs konkrét név. Ezt mondják: kvantumdinamika. Így a molekuláris modellezés területe négy négyzetre osztható:

  1. klasszikus kernelek – klasszikus potenciál (klasszikus MD),
  2. kvantummagok – klasszikus potenciál (kvantumdinamika a klasszikus potenciálban),
  3. klasszikus magok – kvantumpotenciál (szemklasszikus MD),
  4. kvantummagok – kvantumpotenciál (nem empirikus kvantumdinamika).

Ugyanakkor a fogalmak és a számítások összetettsége nő balról jobbra és alulról felfelé. Akkor is hozzáadhat egy harmadik dimenziót – ha a molekulát szakaszokra osztják, akkor mindegyiküket másképp fogják leírni. Például az enzim aktív központját pontosabb modell írja le, a többi pedig kevésbé pontos. Elvileg lehetséges mind a négy négyzetet összevonni, de általában elméleti kémikusok két balkezeset használnak, az úgynevezett QM / MM módszereket (kvantummechanika / molekuláris mechanika). Ezeket a módszereket nevezhetnénk – félklasszikus MD / klasszikus MD. De a kémikusok, még elméletiek is, nem mindig szigorúan és egységes módon közelítik meg a terminológiát.

Két gonosz

Minden modell egyik fő jellemzője annak pontossága. Hogyan vannak pontosan a dolgok a négyzetekben? A felhalmozott tapasztalat azt mutatja, hogy a magok mozgása nem mindig, de összességében jól jellemzi a klasszikus pályák: végül is a magok hasonlítanak a golyókra, csak kissé homályosak, a térben elkenődnek. A kulcsszó "hasonló", és nem pontosan egyforma.Így a klasszikus magok alkalmasak a molekulák minőségi leírására, azonban nem lehetséges kémiai pontosság (a kísérlethez hasonlóan) a molekuláris dinamika felhasználásával.

Ami a klasszikus potenciál-erőmezőket illeti, azok sem nagy pontosságúak. A magok közötti kölcsönhatás bemutatása egyszerű matematikai képlet formájában már jelentős hibát jelent. Íme egy példa. Vegyünk kísérleti adatokat (mondjuk egy molekula vibrációs spektrumát), és standard eljárások alkalmazásával az erőmező paramétereit alapozzuk meg. És most, ezzel az erőterülettel elméletileg kiszámítjuk ugyanazt a vibrációs spektrumot. Kiderül, hogy más, bár erősen hasonlít az eredeti. Az egyszerűség kedvéért pontosan kellett fizetnem. Ráadásul, mivel a mezők empirikusak, az eredmények nagymértékben függenek a kísérleti adatok minőségétől és a terület relevanciájától a tárgyhoz. Tehát a biomolekulák számára létrehozott mezők nem adnak megbízható eredményt, mondjuk az elektrolitoldatokra.

Tehát minden négyzet, kivéve a teljesen kvantumot, félkvantitatív vagy akár minőségi számítások.És csak a kvantum-potenciál kvantum dinamikája van kémiai pontossággal.

A pontosság mellett gyakran beszélnek a modell prediktív erejéről. Úgy tűnik, hogy a mi esetünkben ugyanaz a helyzet: pontos eredmények – pontos előrejelzések. Mindazonáltal a nagy pontosságú számítások annyira összetettek, hogy még a modern szuperszámítógépek használatával a kutatókat a legjobb esetben több tíz atomra korlátozzák. Ez azt jelenti, hogy a komplex vegyi rendszerek (biomolekulák, oldatok, polimerek stb.) Pontos kvantummodelleinek prediktív ereje valójában nulla. Nem a pontos és pontatlan számítások közül kell választani, hanem eközben legalább egyáltalán vagy egyáltalán nem. A kémikusok gyakorlására a válasz nyilvánvaló: számít. És itt a QM / MM talán a legjobb dolog a gyakorlati eszköztárban.

Pragmatikus Nobel-bizottság

A Nobel-díjat csak a QM / MM, a molekuláris dinamika és a klasszikus erőmezők kapta. Vagyis az áramkör teljes területére, kivéve a nagy pontosságú kvantummechanizmusokat. Ez sok mindent megzavarja, akik meg vannak győződve arról, hogy a túl közelítő módszerek ideiglenesek (vagy akár gonoszak).Előbb vagy utóbb ez a csodálatos idő lesz, amikor nem lesz sem golyó, sem bot, és mindenki csak szigorú kvantum megközelítést alkalmaz – a kémiai elméleti gondolat koronáját. A Nobel-bizottság azonban bejelentette, hogy a korona egyszerűbb és pragmatikusabb módszerek.

Be kell vallanom, hogy mindent elment ez. A kvantumdinamika nagyszerű, de széles körben elterjedt alkalmazása a távoli jövőben fanyar szempont. Mint a klasszikus írta: "Kár csak, én sem én, és nem is kell majd élnünk ebben a gyönyörű időben." Eközben a QM / MM számítások egyre népszerűbbek, eredményük inkább keresett, mint a szigorú kvantumszámítások eredményei. Elfogadhatók az általános kémiai folyóiratok kiadványaihoz hasonlóan Angewandte chemie vagy JACS (Journal of American Chemical Society). A biológiai rendszerek QM / MM segítségével történő kiszámítása még akkor is, ha nem nagyon pontos (vagy akár nagyon pontatlan), sokkal érdekesebbnek tűnik, mint a kvantumdinamika – pontos, de csak a kicsi és gyakran jól tanulmányozott molekulákra. És ebben persze ott van a kémiai közösség pragmatikus logikája: továbbra is fontolóra veszi tudományos kísérletét, és az elméletből nem annyira pontossággal és koncepcionális újdonsággal, mint a hozzáférhetőséggel és a jelenlegi problémákkal kapcsolatos relevanciával rendelkezik.

A főbb kvantumkémiai módszerek Walter Cohnt és John Pople-t hoztak létre, amelyért 1998-ban Nobel-díjat kapott. A kvantumkémia pedig a XIX. Század első harmadában kifejlesztett kvantummechanikából nőtt ki, és 1918-tól 1933-ig öt Nobel-díjat (1933-ban Erwin Schrödinger és Paul Dirac kapott).

Azonban meg lehet tekinteni, hogy ez a történet 1869-ben kezdődik, amikor Jan Diederick van der Waals fontos felfedezést tett – megmutatta a gyenge interatomikus és intermolekuláris kölcsönhatásokat, amelyek a pillanatnyi vagy indukált dipólusok között fordulnak elő. Hála neki, ezek a gyenge erők a tudósok figyelmét felismerték – csak néhány tízezer joule / mól tartalom szerint (összehasonlítás céljából az O-molekula kötési energiája2 tizenötszer több). A van der Waals által nyert molekulák kölcsönhatási lehetőségeit, valamint a Coulomb elektrosztatikus potenciálját 1946-ban három tudóscsoport végezte, akik létrehozták az első algoritmust a molekuláris rendszerek modellezéséhez. A vezető Frank Westhimer csoportja volt, amely megpróbálta alkalmazni bizonyos fizikai ágakat (elektrosztatika és statisztikai mechanika) a szerves molekulákra.

Mindezek a vizsgálatok vezettek annak megértéséhez, hogy miként kell meghatározni a potenciális intermolekuláris kölcsönhatás, és a megjelenése számítógépek lehetővé tette ezen a területen, hogy fejlessze tovább. Norman Ellindzhera tekinthető úttörőnek település Chemistry (számítástechnikai kémia) Mivel először létre az algoritmus, és megírta az első számítógépes program, hogy optimalizálja a szerkezet a molekulák. Tehát MM módszerek (molekuláris mechanika). Ezek-atomot tartalmaznak, magától töltésű tömeges pont, és a program keres egy minimális potenciális energia a különböző elrendezése pont díjak a térben, kiválasztja kötéshossz, kötésszögeket, torziós szögek, teljesítmény csatolási állandók, az értékeket a paraméterek a részleges díjak és a Van der Waals erők.

Egy különösen érdekes alkalmazása módszerek molekuláris mechanika biológiailag aktív szerves molekulák, mint például a fehérjék. A molekula egy részük millió atomtömeg egység – például Titina molekula, amely fontos szerepet játszik csökkentésében harántcsíkolt izom. Nyilvánvaló, hogy a tanulmány a fehérjék szerkezete – prioritást élvez. Algoritmusok segítségével és Uesthaymera Ellindzhera másik tudóscsoport (George Némethy és Harold Scheraga) vette fel a vizsgálat fehérjemolekulák.Mint már említettük, a molekuláris mechanika módszerei a minimális energiameghatározás elvén dolgoznak. Miután megtalálta az ilyen minimális energiának megfelelő struktúrát, a program a legvalószínűbbnek tekinti. A következő lépés a kvantummechanikai módszerek alkalmazása az intermolekuláris és intramolekuláris potenciálok kiszámítására. Ezen a területen az egyik Nobel-díjas Arieh Varshel dolgozott. Ő és Shneir Lifson elsőbbséget élveztek az erőmező módszer kidolgozásában (következetes erőteret, CFF), amely egy atomrendszer minimális potenciális energiájának kutatásán alapul.

Arieh Varshel 1940-ben született a Kötelező Palesztinában. Sikerült háborút szerezni, és miután elérte a kapitányt, 1966-ban belépett a Haifai Technion Egyetemre. Miután megkapta a doktori címet 1969-ben, Warshel megérkezett a Martin Karplus laboratóriumhoz a Harvard Egyetemen, hogy vállaljon posztdoktori gyakorlatot. 1976 óta a Dél-Kaliforniai Egyetemen dolgozik, 1984 óta professzornak. Fő kutatási érdekei a számítógépes módszerek alkalmazása a biológiai molekulák strukturális működésének meghatározására.

Martin Karplus 1930-ban született Bécsben, és 1938-ban anyjával és testvérével költözött az Egyesült Államokba, elmenekült a nácik elől.1951-ben végzett a Harvard College-ban, 1953-ban doktori fokozatot szerzett a California Institute of Technology-ban, ahol kétszeres Nobel-díjas Linus Pauling-nal dolgozott. Talán Pauling nagy hatással volt Karplus korai munkáira.

A huszadik század eleji közös munka során Varshel és Karplus molekulák modellezésével nagyszámú konjugált többszörös kötéssel foglalkozott.

Olyan programot írtak, amely kiszámíthatja a hasonló molekulák spektrumát, és a klasszikus számítási módszer és a kvantummechanikai megközelítés kombinációja volt: a π-elektronokat kvantummechanika és σ-elektronok segítségével, molekuláris mechanika segítségével írják le. Ez volt az első munka, amely kimutatta, hogy mindkét megközelítés egyszerre használható. Karplus és Varshel megfogalmazta azt az elvet, hogy az elektronokat fel lehet osztani a klasszikus modellbe, és azokat, amelyeket kvantum-kémiai módszerekkel írnak le. Ezenkívül a klasszikus és a kvantum kémiai alrendszerek közötti energiacsere-rendszereket, valamint a molekula és a molekula környezetét is létrehozták.

Később 1976-ban Warshel és Michael Levitt ugyanazt az elvet alkalmazta a lizozim molekula reakcióinak szimulálására. Michael Levitt 1947-ben született Pretoriában (Dél-Afrika). 1964-ben költözött az Egyesült Királyságba. Levitt 1971-ben szerezte doktori tanulmányait a Gonville és a Kiz College-ban, és előtte egy ideig a Rehovot-i Weizmann Intézetben (Izrael), ahol Arieh Warshel volt a felügyelője. 1987 óta a Stanford University Medical School professzora a strukturális biológia professzora.

Három tudós – Varshel, Karplus és Levitt – sikeresen ötvözte a klasszikus (molekuláris mechanika) és a kvantummechanikai megközelítéseket, hogy sikereket érjen el a komplex molekulák számításában. Az ezzel a módszerrel kapott spektrumok (π-elektron és vibrációs) jó egyezést mutatnak a kísérleti adatokkal. Talán ez a szerző legfőbb eredménye.

Általában miért gondolják ezeket a fehérjék és más makromolekulák szerkezetét? Végtére is, néhány számított adatot nem igazolnak valódi kísérletek, és biztosan nem erősítik meg. Vagy csak egy kísérletre van szükségünk. szilikagélen? Ebben a tekintetben vannak különböző vélemények.Nyilvánvaló, hogy a legmegfelelőbb tudományos megközelítés a "kísérlet – számítás – elmélet – gyakorlati alkalmazás" kiegyensúlyozott kombinációjából áll, mivel ezek közül az összetevők közül egyetlen sem ad választ a "miért" kérdésre. A fehérjék és más biomolekulák szerkezetének kiszámítása szükséges ahhoz, hogy megértsük szerkezetük jellemzőit és szerepet játsszanak a szervezetben. Mi lehet fontosabb, mint a készülék részei, amelyekből készültek? Azonban ugyanolyan fontos, hogy megtanuljuk, hogyan hozzunk létre új molekulákat a szükséges biológiai aktivitással – ideális gyógyszerek.

Kámfor a QM / MM fényében

A szerkesztők kérésére az előző cikk szerzője példát mutatott arra a problémára, amelyet a Nobel-díj odaítélésének módszerével oldott meg. A munkát német tudósok végezték, és 2004-ben jelent meg az American Chemical Society folyóiratban (126. kötet, 4017. o.).

Camphor C10H16O – természetes anyag, keton terpénes sorozat, amely számos illóolaj részét képezi, és széles körben használják az orvostudományban. Bár kámfor és természetes eredetű, de sok szervezet számára, beleértve az embert is, idegen vegyület (xenobiotikus). Bármilyen xenobiotikus test fokozatosan bomlik és eltávolítja, még akkor is, ha gyógyhatású hatású.

Az idegen anyagok megsemmisítésének legfontosabb eszköze a "citokróm P450" elnevezésű enzimcsalád. Ezek a hemoproteinek osztályába tartoznak, vagyis a hemet tartalmazó fehérjék, vagy inkább a kétértékű vas-porfirin komplex komplexum, amely felelős a vérben lévő oxigén szállításáért, a hemoglobin aktív központjához (a leghíresebb hemoproteinhez). Vannak más fontos képviselői ennek az osztálynak a fehérjék. Például a citokróm P450 egy univerzális eszköz a xenobiotikumok elpusztítására: szinte minden élő szervezetben megtalálható, és különböző szerves anyagok oxidálására képes oxigénatomot a szén és a hidrogén között: C-H + O = C-OH. Ezeket a P450 enzimeket univerzális monooxigenáznak nevezik (egy oxigénatom hozzáadásával).

Mint ismeretes, a máj felelős az emberi test tisztításáért, mely sejtekben a monooxigenáz-rendszer működik.

feladat

Mint egy tündérmese: fehérje "zsebében", zseb – porfirinben, porfirinben, vasban, vasban, oxigénatomon. Ez a vas-oxigén kötés a "tű" – a xenobiotikumok halála. A víz és a kámfor bejut a zsebébe, amelynek egyik kötését a vason található oxigén oxidálja. A kérdés az, hogy ez hogyan történik: egy vagy két szakaszban.A szén és a hidrogén egy háromszög alakú átmeneti állapotban (C-H-O) vagy oxigénnel azonnal beágyazódik, vagy egy kétlépcsős mechanizmus létezik, amelyet újrakötésnek neveznek. Először is, a kámfor a hidrogénatomot oxigénhez adja, és a keletkező csoport az aktív centrumból leválik. Ezután csatlakozik a központhoz, mind hidrogénnel, mind oxigénnel, vagyis a hidroxilcsoport -OH-val. A kísérleti megfigyelések nem adnak teljes képet, de kissé ellentmondanak egymásnak. Ezért csak akkor lehetett pontosan megérteni, hogy az oxidáció hogyan történik számítógépes szimulációval.

döntés

Feladatunk a QM / MM tipikus esete. A "víz, fehérje és szubsztrát (kámfor)" mérete hatalmas, körülbelül 24 számítással, nem pedig a klasszikus erõmezõkkel. Természetesen használhatja az erőteret, de az eredmények nem adnak egyértelműséget, de csak még több ködöt engednek be.

A kihívásra adott válasz a "megosztás és a meghódítás", vagyis a QM / MM. Az aktív központot és a szubsztrátot – és ezek több tucat atomot – kvantumpotenciál segítségével írják le. Minden más – fehérje "zseb" és az oldószer – a klasszikus erőterek segítségével.Így elérjük a leírás pontosságának és teljességének egyensúlyát.

Minden nagyon egyszerűnek tűnik. A gyakorlatban azonban a QM / MM számítások gyakorlata óriási kísérletet és hibákat, valamint az elméleti módszerek kalibrálását foglalja magában – csak a számítások eredményei lehetnek megbízhatók legalább minőségi szinten.

A válasz

A válasz egyértelmű: a reakció két fázisban megy végbe, vagyis a kámfor oxidációs mechanizmusa újra kötődik. A részletek nélkül elmondhatjuk, hogy a kutatók képesek voltak megmagyarázni mindazokat a kísérleti megfigyeléseket, amelyek a szimuláció előtt is ellentmondásosak voltak. Ráadásul a kámfor-monooxigenáció mechanizmusának meghatározása fontosabb, mint amilyennek látszik. Ne felejtsük el, hogy a P450 univerzális enzim, amely számos xenobiotikumot oxidál, és számos nagyon különböző élő szervezetben jelen van.


Like this post? Please share to your friends:
Vélemény, hozzászólás?

;-) :| :x :twisted: :smile: :shock: :sad: :roll: :razz: :oops: :o :mrgreen: :lol: :idea: :grin: :evil: :cry: :cool: :arrow: :???: :?: :!: