Nobel-díj a kémia területén - 2017 • Arkady Kuramshin • Tudományos hírek a "Elemekről" • Nobel-díjak, mikrobiológia, molekuláris biológia, technológia

Nobel-díj a kémia területén – 2017

Ábra. 1. A 2017-es Nobel-díj nyertesei. Balról jobbra: Jacques Dubose, Joachim Frank és Richard Henderson. Fotók sciencenews.org

A múlt héten bejelentették, hogy a 2017-es svájci Nobel-díjat a kémia fogják fogadni a svájci Jacques Dubose, a német-amerikai Joachim Frank és a Scot Richard Henderson a "nagy felbontású krioelektromos mikroszkópos módszerek kifejlesztésében, hogy meghatározzák a biomolekulák háromdimenziós szerkezetét a megoldásban". Munkájuk lehetővé tette a múlt század nyolcvanas éveinek kezdetén, hogy ilyen típusú mikroszkópos vizsgálatot végezzen és fokozatosan javítsa, hogy az elmúlt években a tudósok a legkisebb részletekben vizsgálhassák a komplex biológiai molekulákat. A Nobel-bizottság megjegyezte, hogy a krioelektronmikroszkópos módszer a biokémiát egy új korszakra fordította át, lehetővé téve, hogy számos hiányosságot töltsön be az életmolekulák és az élő rendszerek tudatában.

A Nobel-bizottság úgy ítélte meg, hogy a legnagyobb hozzájárulás a krioelektromos mikroszkóp kifejlesztéséhez – egy olyan módszer, amely vizuálisan megvizsgálja a fehérjék, nukleinsavak és egyéb molekulák bonyolult szerkezetét, valamint megvizsgálja a Jacques Dubochet német származású amerikai Joachim Frank és Scot Richard Henderson.

Közvetlenül megjegyezzük, hogy a kriogén elektronmikroszkóppal aligha nevezhetünk egy alapvetően új és önellátó anyagi fizikai kutatás módszereit. Inkább egyfajta transzmissziós elektronmikroszkópia (ez a módszer egyik szerzője, Ernst Ruska 1986-ban kapott Nobel-díjat), amelyet kifejezetten mikrobiológiai tárgyak tanulmányozására alakítottak ki.

Ábra. 2. Egy krioelektromos mikroszkóp a Northwestern University-ben, az USA-ban. Fotók a vox.com-ból

Egy transzmissziós elektronmikroszkópban az elektronok számára átlátszó minta (általában tized és százmillió mikron) átlátszó elektront vesz át egy eléggé elegendő elektronon keresztül, amely a mintán áthaladva felszívódik és szétszórva megváltoztatja a mozgás irányát. Ezeket a változásokat regisztrálni lehet (most a CCD mátrix, amelynek alkotói Willard Boyle és George Smith 2009-ben nyerték el a Nobel-díjat a fizikában) leggyakrabban használják, és elemzés után a vizsgált objektum képét a gerenda merőleges síkjában kapják. Az elektronok belső hullámhossza (az energiák tizedik picométerejellemző elektronmikroszkóp) sokkal kisebb, mint hullámhosszú fény a látható tartományban (több száz nanométer), elektronmikroszkóp segítségével, akkor „látni” sokkal nagyobb részletességgel optikai mikroszkóppal, beleértve fluoreszcens mikroszkópia, nagy felbontású (FMVR) alakult 2014 Nobel-díjas kémikusok, Eric Betzig, Stefan Khellem és William Merner.

Az elektronmikroszkópok korlátozó felbontása – néhány angstrom (nanométer tized) – szinte elérték. Ez lehetővé teszi olyan képek beszerzését, amelyekben például az egyes atomok megkülönböztethetők. Összehasonlításképpen: az fMBP lehetőségeinek határa 10-20 nm. De csak azért, hogy összehasonlítsuk a végső felbontás különböző módszereit, meglehetősen értelmetlen. Az elektronmikroszkópok nagy felbontásúak, de nem mindig használhatók. Az a tény, hogy a minta az elkészítés során történő őrlés mellett túlságosan súlyos besugárzást valósít meg egy elektronsugárral a vizsgálat során (nagyjából, annál intenzívebb a gerenda, kevesebb hiba és jobb az eredmény) vákuum alatt (vákuum szükséges a tápközeg nem szétszórta az elektronokat a mintán kívül, ezáltal szükségtelen torzítást vezetett be).Ezek a feltételek teljesen alkalmatlanok, ha bonyolult biológiai molekulákat és tárgyakat kell tanulmányoznunk – károsodnak egy ritka környezetben, és vannak olyan meglehetősen gyenge kötvények, amelyek egyszerűen összeomlanak a vizsgálat során.

Az a megértés, hogy további fejlesztések nélkül az elektronmikroszkóp nem igazítható a biomolekulák és az élő rendszerek vizsgálatához, amely majdnem a találmányt követően jelent meg. Erről például három évvel később írta Ernst Ruska 1931-ben az elektronmikroszkóp működési elvének bemutatását követően Ladislav Marton magyar fizikus (L. Marton, 1934: Biológiai tárgyak elektronmikroszkópiája). Ugyanebben a cikkben Marton javasolta a probléma megoldásának módjait. Különösen arra is rámutatott, hogy a fagyasztási minták csökkenthetik az elektronsugaras besugárzás károsodását. Fontos megjegyezni, hogy bár ezt Marton cikkében nem jelezzük, a minta fagyasztása szintén segít a molekulák hő-rezgésének csökkentésével, ami szintén hozzájárul a kép kialakulásához.

Az 1970-es és 1980-as években a tudomány és a technológia elégséges fejlődést ért el a nehézségek leküzdése érdekében. És ez nagyrészt az idei díjátadók erőfeszítéseinek köszönhető.

Richard Henderson volt az első beérkezett transzmissziós elektronmikroszkóppal (hűtés közben a minta), a kép egy aszimmetrikus fehérje atomi felbontású. Kutatását a hetvenes évek közepén kezdte. És Henderson először megpróbálta a szerkezetét számos fehérje a sejtmembránból, röntgensugár-diffrakciós módszerrel, ami még akkor is meg kell adni az engedélyt, hogy néhány angström. Azonban hamar kiderült, hogy ez a módszer nem jó eredmény elérése: a vizsgálandó anyag kristályos formában, mint a membrán fehérjék kivont környezet, vagy rosszul kristályosodott, vagy akár elvesztik formájukat. Aztán átkapcsolt az elektronmikroszkópiára.

A specifikus fehérjét választották – a baktériumosoxin – és úgy döntöttek, hogy nem távolítják el a membránról, hanem közvetlenül megvizsgálják. A tudósok ezenkívül a mintákat glükózoldattal fedték le, hogy megóvják a vákuumban való száradástól. Ez segített megoldani a szerkezet megőrzésének problémáját. Ezután Henderson és munkatársai a minták megsemmisítésével kapcsolatban már leírt problémát szembesítettek egy elektronsugár hatása alatt.Segítettek számos tényező kombinációjának megoldásában.

Először is, a baktériumbetopszin rendszeresen a membránban helyezkedik el, így a szabályosság gondos mérlegelése és a különböző szögekből történő felvétel együttesen sokat segít a kép ábrázolásakor. Ez segített csökkenteni a gerenda intenzitását és csökkenteni az expozíciós időt, de minőséget nyerni. Már 1975-ben a fehérje képét 7 angstrom felbontással lehetett kinyerni (3. Ábra, lásd R. Henderson, P. N. T. Unwin, 1975. A lilúmembrán háromdimenziós modellje elektronmikroszkóppal).

Ábra. 3. A bal oldalon: az egyik legfontosabb "pillanatfelvétel" a bakteriális membrán Halobacterium halobiumamelyet a Henderson csoport nyert el. Fekete vonalakmint a matt szőrzet, a baktérium-homopszin molekulák nyomai. Látható, hogy ezek elsősorban a képsíkra merőlegesek. Szaggatott vonal körüljárta a fehérje egy molekulájának becsült határát. jobbra: a biorhodopsin molekula szerkezetének háromdimenziós modellezésének eredménye 7 angström felbontással. R. Henderson, P. N. T. Unwin, 1975. kép. Az elektronmikroszkóppal nyert membrán háromdimenziós modellje

Másodszor, Hendersonnek lehetősége volt különböző tudományos központokba utazni és különböző elektronmikroszkópokat kipróbálni. Mivel ezekben az években nem volt egységesítés, a különböző mikroszkópoknak előnyei és hátrányai voltak: különféle kamrai evakuálás,a minta különböző hűtési foka (ez csökkenti az elektron besugárzásának károsodását), az elektronsugarak különböző energiáit, az érzékelők különböző érzékenységét. Ezért az azonos tárgy különböző mikroszkópokon történő tanulmányozásának lehetősége lehetővé tette, hogy először kiválasszák a "legkevésbé kedvezőtlen" feltételeket a kép előállításához, majd fokozatosan javítsák őket. Így Henderson felhalmozta az adatokat, és egyre pontosabb struktúrát kapott a bakterhodopszin. 1990-ben megjelent egy olyan cikket, amelyben a fehérje modelljét atomi felbontással mutatták be (R. Henderson és munkatársai, 1990).

Ábra. 4. A transzmissziós elektronmikroszkópos módszerrel kapott bakteriodopszin-modell – példaként ezt a vegyületet használva Richard Henderson megmutatta annak lehetőségét, hogy a módszer biológiai objektumok képeinek atomi felbontással történő előállítására alkalmas. Vastag, különböző színű vonalak – kémiai kötések a bakterin-hidroxipin atomok, fehér háló felületek mutatják az elektronsűrűség határait az atomok és atomi csoportok köré. Ábra R. Henderson és munkatársai, 1990. A bakteriodopszin szerkezetének modellje nagy felbontású elektron-kriok mikroszkópián

Ennek az úttörő tanulmánynak a során Henderson megmutatta, hogy a krioelektromos mikroszkópia felbontással képes képet készíteni,ami nem rosszabb, mint a röntgen-analízis – abban az időben áttörés volt. Mindazonáltal ez az eredmény lényegében arra a tényre támaszkodott, hogy a bakteriodopszin rendszeresen a sejtmembránban helyezkedik el, és nem volt világos, hogy más, "szabálytalan" molekulák számára ilyen felbontást lehet-e elérni.

A véletlenszerűen elhelyezkedő biológiailag aktív molekulák gyenge jelének feldolgozásának problémáját egy másik 2017-es Nobel-díjas Joachim Frank megoldotta. Fő alkotóeleme a krioelektronmikroszkópiának az algoritmusok létrehozása a krioelektromos mikroszkópiával kapott kétdimenziós képek elemzésére, amely lehetővé teszi számunkra, hogy kiváló minőségű háromdimenziós modellt hozzunk létre. Hasonló algoritmusokat már kifejlesztettek más mikroszkópos módszerekkel. Frank optimalizálta és sok szempontból finomította a matematikai analízis módszereit, amelyek lehetővé teszik, hogy az elektronmikroszkópos vizsgálat során kapott hasznos információkat elkülönítsék a zaj okozta jelektől. A pontos elektronikus eszközökben zajok különböző okokból keletkeznek: az áram és a feszültség véletlen ingadozása az egyenetlen elektro- mos kibocsátásnak köszönhető,a félvezető blokkok töltőhordozóinak (vezetékelektronok és lyukak) képződésében és rekombinációjában, az áramvezetők vezetőinek (termikus zaj) vagy külső beavatkozások hőátadásához (annak ellenére, hogy minden rendszerint jól szigetelt).

Ábra. 5. A jelek számítási módszerei a cryoelektron mikroszkópiában, amelyet J. Frank javasol. Rendszer a nobelprize.org oldalról

Ezt a feladatot is bonyolítja. Ha az objektumok, még akkor is, ha azok ugyanolyanok vagy közel azonosak, mint amilyennek ilyen vizsgálatokban kellene lenniük, rendezetlenek, kissé eltérő jeleket adnak a szerkezetükben, amelyek elszíneződhetnek egymással. Ráadásul az ilyen elmosódási zaj vagy algoritmus hibáinak oka nem könnyű meghatározni. Az adatfeldolgozás elvét az 1. ábrán mutatjuk be. 5. ábra: a vizsgált molekula számos sík képét zajtalanítják és a "szögek" szerint tipizálják, majd jobb minőségű profilt építenek be szögletes képekből, és végül egy háromdimenziós modell épül ki ezekből a profilokból.

1981-ben Frank összefoglalta matematikai modelleket a SPIDER számítógépes program első verziójában (System for Processing Image Data Electron Microscopy és Related Areas, első publikáció: J.Frank és munkatársai, 1981. Spider – Moduláris szoftverrendszer elektron képfeldolgozáshoz). Ez a szoftvercsomag létezik, és napjainkig frissül, ráadásul ezek a programok szabadon terjeszthetők, ami minden bizonnyal megkönnyíti a tudósok munkáját az egész világon. Frank saját algoritmusait használta a riboszóma felszínének – az RNS-ről és a hozzájuk tartozó sejt-organoid fehérjékből álló – képeiből, amelyek a genetikai információ alapján az aminosavakból származó fehérjék bioszintézisére szolgálnak.

Ábra. 6. A cryoelektron mikroszkópos minta előkészítésének módszere, amelyet J. Dubcecher javasolt. Rendszer a nobelprize.org oldalról

előtag "Cryo" megjelent az elektronmikroszkópiában a harmadik díjas Jacques Duboche-nak köszönhetően. Módszert dolgozott ki a vizes oldatok gyors hűtésére mintákkal (J. Dubochet, A. W. McDowall, 1981. A víz vitrifikálása elektronmikroszkópiához). Ráadásul a víz olyan gyorsan fagyasztható, hogy a molekuláknak nincs ideje felkészülni a kristályrácsra, és fagyosnak lenni (lásd amorf jég). Ezt úgy érjük el, hogy az oldat vékony filmét egy folyadék etánnal ellátott tartályban egy -160 ° C-ra hűtött oldatba merítjük (6. A helyes módszer a fagyasztásnak nevezhető az egész módszer sikerének kulcsa, hiszen a rendezett jégkristályok okozhatnak elektrondiffrakciót, torzíthatják a vizsgált molekulákkal kapcsolatos információkat.A fehérjék és a nukleinsavak nagy molekulatömegének köszönhetően ezek a molekulák könyörtelenek, így azonnali fagyasztással nem rendelkeznek idővel sem a pozíciójuk megváltoztatására, sem az alakváltozásra. Vagyis a biológiailag aktív molekulák szerkezete a gyors fagyás alatt ezzel a módszerrel nem változik. Ezzel a Dubboche-t először a cryoelectron mikroszkópiával vizsgálták a vírusok szerkezetének tanulmányozására (lásd 7. ábra, M. Adrian és munkatársai, 1984. vírusok krii-elektronmikroszkópos vizsgálata).

Ábra. 7. A bal oldalon: a T4 bakteriofág képét, melyet a J. DuBoche csoport hoz létre. Teljesen különbözhet a virális részecskék. jobbra: a vírus háromdimenziós modellje. M. Adrian és munkatársai, 1984. cikk. Vírusok mikrobiológiai mikroszkópiája és tudományos képalkotás.

Az 1990-es és 2000-es években a kriokelektron mikroszkópia fokozatosan fejlődött és javult a számítási teljesítmény és a műszeres pontosság fejlesztésével. De a krioelektromos mikroszkóp valós virágzása 2012-ben kezdődik. Közvetlen CMOS-alapú elektronikus detektorok megjelenésével jár, amelyek közvetlenül érzékelhetik a mintán áthaladó elektronokat. Ez lehetővé tette számunkra, hogy egyszerűsítsük az elektronmikroszkópok tervezését, eltávolítva az összpontosító és jelátalakító komplex rendszert, és csökkentve a csomópontok számát, amelyek véletlenszerű zajokat okozhatnak.Ennek eredményeképpen a krioelektromos mikroszkópos módszer felbontása 2-3 angströmre nőtt (8.

Ábra. 8. A béta-galaktozidáz enzim példáján az elmúlt évek során javult a kriokelektronmikroszkópos felbontás. Kép a vox.com-ból

Így 2017-ben, majdnem hat évtizeddel a Max Perutz hemoglobin szerkezetének kristályos meghatározása után (Max Perutz és John Kendru "1962-ben a globális fehérjék szerkezetének megismeréséért Nobel-díjat kaptak), a krioelektronmikroszkópia lehetővé tette ennek a fehérjének egyetlen molekuláját kristályban és oldatban (9.

Ábra. 9. fent: a hemoglobin-kristály röntgenfelvétele, J. D. Bernal, I. Fankuchen & Max Perutz, 1938. cikkéből származó kép. A kimotripszin és a hemoglobin röntgenvizsgálata (a bal oldalon) és rekonstruálták a hemoglobin molekula roentgenogram 3D-szerkezetére (a jobb oldalon). Alul: a hemoglobinmolekulák különböző előrejelzései, amelyek egy krioelektromos mikroszkóppal (a bal oldalon) és ennek a molekulának egy háromdimenziós modellje (a jobb oldalon), M. Khoshouei és munkatársai, 2017. képi. A hemoglobin Cryo-EM szerkezete 3,2 E-nál a Volta fázislapján meghatározva. Jobbra fent: hemoglobin molekula modell az rcsb.org-ból

Pontos információ a biológiailag aktív vegyületek szerkezetérőlaz egymással való kölcsönhatásuk sajátosságai és a biokémiai folyamatokban való részvételük fontos mind az alapfogalmakban, mind a gyakorlati problémák megoldásában, például új gyógyszerek kifejlesztésében és új módszerek kialakításában a betegségek kezelésében.

A kriokelektron mikroszkópia gyakorlati alkalmazásának egyik példája a Zika-vírus vizsgálatának (10. A Zika 2016-ban Brazíliában elkövetett járvány kitörése során a kutatók több hónapot töltöttek a vírus struktúrájával kapcsolatos információk megszerzésére cryoelectron mikroszkópiával (D. Sirohi és mtsai, 2016. A Zika vírus 3,8 Å felbontású krio-EM szerkezete).

Ábra. 10. A Zika vírus szerkezetét kriokelektron mikroszkóppal határozzuk meg. Ábra virology.ws

Egy másik példa az, hogy az idei krioelektromos mikroszkópia lehetővé tette a herpeszvírusok családjának – a humán cytomegalovírus családjának (X. Yu és munkatársai, 2017.) – legnagyobb képviselőjének kapszid szerkezetét. A vizsgálat eredményei alapul szolgáltak azon vírusok kapszid lehetséges szakaszainak kutatásához, amelyek molekuláris célpontokká válhatnak az antivirális gyógyszerek számára.

Arkady Kuramshin


Like this post? Please share to your friends:
Vélemény, hozzászólás?

;-) :| :x :twisted: :smile: :shock: :sad: :roll: :razz: :oops: :o :mrgreen: :lol: :idea: :grin: :evil: :cry: :cool: :arrow: :???: :?: :!: